Tutti i WP definiti nell'operational plan hanno raggiunto gli obiettivi prefissati. Si evidenziano in particolare i risultati delle indagini di laboratorio.

Con riferimento al WP_D (identificazione dei metaboliti costituenti il fitocomplesso), si è concluso con il pieno raggiungimento degli obiettivi prefissati e con la definizione di un profilo fenolico di riferimento per l’intero sviluppo progettuale. La caratterizzazione chimica ha permesso di delineare un profilo compositivo ad alta complessità, tipico delle foglie di olivo, ma distinto per la concentrazione e il rapporto tra le diverse classi di composti, segno della specificità del processo estrattivo impiegato.

L’estratto è stato caratterizzato per il contenuto e tipologia di:

Secoiridoidi (47%, oleuropeina, ligustroside, oleoside e demethyl-oleuropeina);
Feniletanoidi (23%, idrossitirosolo, tirosolo e verbascoside);
Flavonoidi (18%, luteolina-7-O-glucoside, apigenina-7-O-glucoside, quercetina rutinoside e diosmetina;
Acidi fenolici (12%, acido caffeico, ferulico, p-cumarico, vanillico e protocatecuico).

La concentrazione media di oleuropeina è risultata pari a 112,4 ± 6,7 μg/mg di estratto secco, mentre l’idrossitirosolo ha raggiunto 38,2 ± 3,1 μg/mg, valori che confermano l’elevata densità polifenolica della matrice.

Il WP_E (identificazione dei metaboliti rilasciati dalla digestione del fitocomplesso) si è concluso con il pieno raggiungimento degli obiettivi sperimentali. L’analisi qualitativa e semi-quantitativa dei campioni digeriti ha evidenziato un rimodellamento profondo del profilo chimico rispetto al fitocomplesso iniziale, soprattutto a carico dei secoiridoidi, soggetti a intensa idrolisi enzimatica: l’oleuropeina è risultata in gran parte trasformata nei suoi principali derivati, idrossitirosolo e acido elenolico.

Anche il verbascoside ha subito una doppia scissione glicosidica, con la liberazione di acido caffeico e di ulteriori tracce di idrossitirosolo. I flavonoidi glicosilati (in particolare luteolina-7-O-glucoside e apigenina-7-O-glucoside) hanno mostrato una parziale deglucosilazione enzimatica, con la comparsa delle rispettive agliconi.

Come atteso, la valutazione della digestione simulata, immagine dell’azione combinata degli enzimi gastrici e intestinali promuovente l’idrolisi dei legami estere glicosidici, ha evidenziato la liberazione di metaboliti più semplici e biologicamente più attivi, come l’idrossitirosolo, aumentato del 240% rispetto alla concentrazione iniziale, o la formazione di 3,4-DHPA, risultato della degradazione ossidativa dell’idrossitirosolo, che è un metabolita secondario di alto interesse farmacologico.

Il ritrovamento di acidi fenolici minori (protocatecuico, ferulico,vanillico) ha evidenziato che anche in assenza di microbiota intestinale è possibile una parziale conversione in metaboliti attivi. In conclusione, il fitocomplesso di Olea europaea mantiene, anche dopo la digestione, un profilo fenolico di elevato valore biologico e il processo di digestione non ne riduce l’efficacia potenziale; anzi, promuove la comparsa di metaboliti più assorbibili e stabili, potenziandone l’impatto fisiologico. Essi rappresentano i substrati della successiva fase di fermentazione colica.

WP_F (identificazione dei metaboliti rilasciati durante la fermentazione del fitocomplesso). Lo scopo prioritario di questo WP era verificare che, a valle dei processi digestivi e fermentativi, il fitocomplesso di Olea europaea non subisse sostanziali alterazioni tali da comprometterne la bioattività e che non comparissero composti potenzialmente tossici o appartenenti a classi di rischio (es. aldeidi reattive, chinoni o nitrofenoli). I dati hanno confermato la piena sicurezza chimica del prodotto fermentato, che si arricchisce di metaboliti bioattivi con proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, prebiotiche e trofiche, in grado di agire sia localmente sul microambiente intestinale sia sistemicamente.

I dati ottenuti non dimostrano, ma suggeriscono che il microbiota femminile tende a massimizzare la produzione di metaboliti fenolici a bassa massa molecolare, mentre quello maschile mostra una maggiore attitudine alla formazione di derivati decarbossilati e di acidi aromatici. Ulteriori studi sono necessari per poter pensare e progettare prodotti , capaci di adattarsi al profilo microbico e metabolico di ogni singolo soggetto, incrementando l’efficacia e la sicurezza d’uso.

WP_G (risk assessment in vivo del prodotto nutraceutico): Infine, gli esperimenti in vivo condotti su embrioni di D. rerio hanno evidenziato che la digestione del nutraceutico aumenta la sua tossicità, con conseguente aumento della mortalità embrionale, concordemente con l’aumento della concentrazione. Nel caso del nutraceuto fermentato, invece, la tossicità scompare.

Quest'ultimo processo ha tuttavia determinato un netto aumento delle malformazioni in embrione, indice di risposta di tossicità sistemica non specifica a dosaggi superiori a 100 mg/L. Su campioni sono stati condotti anche saggi comportamentali che non hanno evidenziato criticità significative. Per i dosaggi più elevati si osservano alcune differenze, in particolare a 400 mg/L per il digerito e 100 mg/L per il fermentato. In sintesi, dalle analisi condotte si osserva un cambiamento solo nei dosaggi più elevati, mentre nei dosaggi più bassi i diversi trattamenti non inducono variazioni comportamentali.

Questi risultati sono in linea con le valutazioni molecolari che hanno evidenziato risposte infiammatorie contenute. Gli estratti post-digestione e post-fermentazione non mostrano effetti pro-infiammatori evidenti, suggerendo che i processi biotrasformativi (digestione o fermentazione) possono modulare selettivamente la risposta infiammatoria, tendendo a riequilibrare l’attività trascrizionale di geni infiammatori chiave, come TNF-α e IL-1β, nel modello di Danio rerio.

WP_H: A conclusione del progetto è stata organizzata una giornata divulgativa, alla quale hanno partecipato aziende, corpi intermedi e ricercatori. Nella giornata è stata presentata la metodologia di raccolta e trattamento delle foglie di ulivo, finalizzata a definire un percorso di economia circolare. Insieme a queste informazioni sono stati forniti anche i risultati analitici di sostanziale non tossicità degli estratti somministrati a basse concentrazioni.

In conclusione, Il progetto ha confermato che il fitocomplesso di Olea europaea possiede un profilo fenolico complesso e altamente bioattivo. Le analisi dimostrano che la digestione e la fermentazione trasformano i metaboliti in forme più biodisponibili, senza introdurre una tossicità significativa. I risultati evidenziano il potenziale nutraceutico del prodotto, la sua sicurezza e la possibilità di sviluppare applicazioni mirate per la salute e il benessere.

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